スタンフォード大学医学部、ピーター・サーナウ編集、カリフォルニア州スタンフォード大学、2020 年 12 月 25 日に承認 (2020 年 10 月 25 日にレビュー)
我々は、複製と進化的保存に不可欠なコロナウイルス転写複合体の複製におけるサブユニット間の相互作用を報告する。われわれは、nsp12に関連するNiRANドメインがトランスでヌクレオシド一リン酸（NMP）トランスフェラーゼ活性を有するという証拠を提供し、その標的としてnsp9（RNA結合タンパク質）を同定した。NiRAN は、Mn2+ イオンおよび隣接する保存された Asn 残基に依存する反応において、保存された nsp9 アミノ末端への NMP 部分の共有結合を触媒します。NiRAN活性とnsp9のNMP化がコロナウイルスの複製に不可欠であることが判明した。このデータにより、ネステッドウイルス酵素マーカーのこの活性を、あるクラスの RNA ウイルスにおける RNA 合成の開始が機能的および進化的に一貫しているという仮説における以前の観察と結び付けることができます。
ニドウイルス目 (コロナウイルス科、アルテリオウイルス科、その他 12 科) の RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (RdRps) は、ポリタンパク質から放出される NiRAN と呼ばれる非構造タンパク質 (nsp) のアミノ末端 (N 末端) ドメインに結合しています。 1ab はウイルスのメインプロテアーゼ (Mpro) で構成されています。以前、動脈ウイルスNiRAN-RdRp nsp自身のGMP化/UMP化活性が報告されており、(現時点では不明)ウイルスへのヌクレオシド一リン酸(NMP)の転移および/または細胞の生重合のためのトランジェントを生成することが示唆されていた。ここでは、コロナウイルス (ヒトコロナウイルス [HCoV]-229E および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) が Mn2+ 依存性の NMP 化活性を有しており、この活性は Mpro 媒介 nsp9 の形成を通じて nsp9 に由来することを示します。 N 末端に隣接する nsps がタンパク質分解によって放出され、ホスホルアミデートが nsp9 の N 末端の第一級アミン (N3825) に結合します。この反応ではウリジン三リン酸が好ましいヌクレオチドですが、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、およびシチジン三リン酸も適切な共基質です。組換えコロナウイルスnsp9およびnsp12タンパク質、および遺伝子操作されたHCoV-229E変異体を用いた変異研究により、NiRAN媒介nsp9 NMP化および細胞培養におけるウイルス複製に必要な残基が決定された。データは、NiRAN 活性部位残基の予測を確認し、in vitro での nsp9 NMP 化およびウイルス複製における nsp9 N3826 残基の重要な役割を決定しました。この残基は、保存された N 末端 NNE トリペプチド配列の一部であり、コロナウイルスファミリーの nsp9 およびそのホモログの唯一の不変残基であることが証明されています。この研究は、他の入れ子ウイルスの NMP 化活性の機能研究に強固な基盤を提供し、抗ウイルス薬開発の可能性のある標的を提案します。
ニドウイルス目プラス鎖 RNA ウイルスは、さまざまな脊椎動物および無脊椎動物に感染します (1、2)。この注文には現在 14 家族 (3) が含まれており、そのうちコロナウイルス家族は過去 20 年間にわたって広範囲に研究されてきました。当時、3 種類の人獣共通感染症コロナウイルスが動物宿主から出現し、ヒトに重篤な呼吸器感染症の大規模な発生を引き起こしました。重度の急性感染症によって引き起こされる持続的なパンデミックを含みます。呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) (4–7)。ニドウイルスは共通のゲノム構成を共有しており、膜結合複製転写複合体 (RTC) のサブユニットは 5-β2 末端の 3 分の 2 にコードされており、ウイルス粒子の主要な構造サブユニットといくつかのアクセサリがコードされています。 。ゲノムの 3??² 末端 3 分の 1 にコードされているタンパク質 (1)。プラナリア ウイルス (モノウイルス科) の 1 科 (8) を除いて、すべての入れ子ウイルスは、ゲノム RNA から翻訳される 2 つの大きなオープン リーディング フレーム (ORF) ORF1a および ORF1b の RTC サブユニットをコードします。ORF1a はポリプロテイン (pp) 1a をコードし、ORF1a と ORF1b は共同して pp1ab をコードします。ORF1a によってコードされる主要なプロテアーゼ (Mpro) の一般的な関与により、pp1a と pp1ab は両方とも、ピコルナウイルスの 3Cpro と相同性があるため、3CLpro としても知られるさまざまな非構造タンパク質 (nsps) にタンパク質分解処理されます ( 9)。これらのnspsは、大きな動的なRTCに組み立てられ、ゲノムRNAの合成（複製）とサブゲノムRNAのセット（転写）を触媒し、ORF1b（10??）の下流に位置するORFの発現を調整するために使用されると考えられています。 ?12)。
コア RTC には、RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (RdRp) (13)、スーパーファミリー 1 ヘリカーゼ (HEL1) (14、15)、および主に ORF1b およびコロナウイルスファミリーでコードされるいくつかの RNA プロセシング酵素が含まれています。アルテリオウイルス科の nsp9-nsp12 (参考文献 10 ～ 12 を参照)。RdRp と HEL1 はツバメの巣ウイルスの 2 つ (5 分の 1) の保存されたドメインであり、他の RNA ウイルスと相同性があります。コアレプリカーゼは、Mproの下流にあるpp1aのカルボキシ末端（C末端）領域から放出されるいくつかの小さなnsps（それぞれコロナウイルスnsp5と動脈ウイルスnsp4）を含む他のサブユニットによって支援されていると考えられている。彼らは家族固有の保護と多様な活動を制限されています（参考文献 10 ～ 12 で概説）。
比較的最近、ユニークな配列モチーフの特徴を持つドメインがすべてのネステッド ウイルスの RdRp に隣接するアミノ末端 (N 末端) で見つかりましたが、他の RNA ウイルスでは見つかりませんでした (16)。その位置とヌクレオチドトランスフェラーゼ (ヌクレオシド一リン酸 [NMP] トランスフェラーゼ) 活性に基づいて、このドメインは NiRAN (Nestvirus RdRp 関連ヌクレオチドトランスフェラーゼ) と名付けられています。NiRAN-RdRpのデュアルドメインの組み合わせは、コロナウイルス科ではnsp12、アルテリオウイルス科ではnsp9を構成し、他のネストウイルス科では、NiRAN-RdRpはウイルスポリタンパク質から独立したnspとして放出されると予想される。コロナウイルスでは、NiRAN ドメインには 450 分の 1 個の残基が含まれており、リンカー領域 (16 ～ 19) を介して C 末端 RdRp ドメインに接続されています。ウマ動脈炎ウイルス (EAV) (アルテリウイルス科) では、組換え nsp9 は Mn2+ イオン依存性 (自己) UMP 化活性および GMP 化活性を示します。これらの活性は、ネストウイルスの 3 つの保存された配列塩基、AN、BN および CN 配列内の残基に依存します。ここで、N は NiRAN を表します) (16)。これらのモチーフの N 末端に隣接するモチーフは、preAN ではそれほど保存的ではありません。これらの残基の一部は、遠縁のプロテインキナーゼにも保存されており、ヌクレオシド三リン酸 (NTP) 結合および触媒活性に関与していることが示されています (20、21)。この観察と一致して、シュードモナス・シリンガエ由来のシュードキナーゼSelOのいくつかの重要な活性部位残基は、最近発表されたSARS-CoV-2 nsp7/8/12/13超複合体で組み立てることができる。電子微細構造に重ねられた保存されたコロナウイルス NiRAN 残基。組換えタンパク質 (17)。文書化された（自己）U/GMP化は、NMPを（現時点では未知の）基質に転移させるための過渡状態を生成すると推測されており（16）、NiRANとプロテインキナーゼの構造的類似性（17、19））。 NiRAN は他のタンパク質を修飾します。
NiRAN は、ネステッド ウイルスとの独自かつ系統的な関連性や RdRp からの遺伝的分離などの多くの特徴により、ネステッド ウイルスにとって合理的な重要な調節酵素となっており、これはウイルスの出現と正体に重要です。以前は、ゲノム/サブゲノムの翻訳または複製/転写を制御する NiRAN に関連する 3 つの機能が考えられていました。当時入手可能なデータが不足していて不完全であることを考慮すると、各関数には長所と短所があります (16)。この研究では、この神秘の領域についての洞察を得るために、2つの属を代表するコロナウイルスの生化学的研究と逆遺伝的研究を組み合わせ、その発見をコロナウイルスファミリーの自然変異の進化的背景に置くことを目的としています。我々は、RTCにおける天然の標的の同定を通じてNiRANの理解が大きく前進したことを報告する。これは（3つの利用可能な仮説のうち）ネステッドウイルスRNAの合成を開始する際のこのドメインの役割に寄与する。この研究は、ウイルス ホスト インターフェイス上での NiRAN の他の役割の可能性も開きます。
コロナウイルス nsp12 関連 NiRAN ドメインの酵素特性を特徴付けるために、C 末端に His6 タグを持つ組換え型のヒト コロナウイルス 229E (HCoV-229E) nsp12 を大腸菌で作製し、 [α32-P ] を含むタンパク質。「材料と方法」に記載されているように、MnCl2 の存在下で NTP と一緒にインキュベートします。反応生成物の分析により、nsp12 (106 kDa) とともに移動する放射性標識タンパク質の存在が示され、コロナウイルス nsp12 がウリジン一リン酸 (UMP) で優先的に形成される共有結合タンパク質と NMP 付加体の形成を触媒することが示されました (図 1A)。 B)。定量分析により、他のヌクレオチドと比較して、UMP 取り込みのシグナル強度が 2 ～ 3 倍増加していることが示されました (図 1C)。このデータは、コロナウイルスの NiRAN ドメインの予測された NMP トランスフェラーゼ活性と一致しています (16) が、コロナウイルスの NiRAN ドメインと動脈ウイルスのヌクレオチド優先性が異なることを示しています。
HCoV-229E nsp12 の自己 NMP 化活性。(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) を、6 mM MnCl2 の存在下で指定された [α-32P] NTP と 30 分間インキュベートしました (詳細については、材料と方法を参照)。反応生成物をSDS-PAGEで分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。(B) 放射性標識タンパク質はリンイメージングによって視覚化されます。nsp12-His6 およびタンパク質分子量マーカー (キロダルトン) の位置を A および B に示します。(C) 放射性シグナルの強度 (平均 ± SEM) は 3 つの独立した実験から決定されました。*P≤0.05。信号強度 (パーセンテージ) は UTP に関連します。
NiRAN 関連酵素活性は細胞培養における EAV および SARS-CoV の複製に不可欠であることが示されていますが (16)、具体的な NiRAN の機能と潜在的な標的はまだ決定されていません。最近報告された NiRAN と、プロテインキナーゼ様の折り畳みを持つタンパク質ファミリーとの構造的類似性 (17、22) により、我々は、NiRAN が他のタンパク質の NMP 化を触媒するという仮説を検証するようになりました。我々は、HCoV-229E ORF1a (nsps 5、7、8、9、10) によってコードされ、それぞれが C 末端 His6 タグを含む非構造タンパク質を含む、潜在的な相同標的のセットを生成しました (SI 付録、表 S1)。 nsp12 の存在下または非存在下で、これらのタンパク質を [α32-P]ウリジン三リン酸 ([α32-P]UTP) とインキュベートします。ウシ血清アルブミンおよび大腸菌で生成したMBP-LacZα融合タンパク質を対照として使用した(図2A、レーン1～7)。放射性標識タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）およびオートラジオグラフィーにより分析したところ、ｎｓｐ１２およびｎｓｐ９を含む反応中に強い放射性シグナルがあることが判明した。シグナルの位置は nsp9 の分子量に対応しており、nsp12 を介した nsp9 の UMP 化が示されています (図 2B、トラック 7)。他の試験タンパク質は UMP 化されていないことが判明したため、nsp9 が nsp12 の特異的な基質であるとの結論に至りました。図 1 に示す自己 NMP 化データと一致して、nsp12 は 4 つの NMP をすべて nsp9 に転送できますが、その効率は異なります (UMP> アデノシン一リン酸 (AMP)> グアノシン一リン酸 (GMP)> シチジン一リン酸 (CMP)) (写真）。3AおよびB）。このアッセイで使用した条件 (反応時間と曝露時間を短縮し、nsp12 の濃度を下げる、材料と方法) では、nsp12 の自己 NMP 化は検出できませんでした (図 2B、レーン 7、および図 1B を比較)。効果的な (そして複数ラウンドの) UMP が nsp12 から nsp9 に移動されたことが証明されました。図 3C に示すように、UMP トランスフェラーゼ活性には Mn2+ イオンの存在が必要ですが、Mg2+ の存在下では最小限の UMP トランスフェラーゼ活性のみが観察され、試験した他の 2 つの二価陽イオンの存在下では活性は観察されませんでした。同様のデータは、シチジン三リン酸 (CTP)、グアノシン三リン酸 (GTP)、およびアデノシン三リン酸 (ATP) を含む NMP 化アッセイでも得られました (SI 付録、図 S1)。
HCoV-229E nsp12 による nsp9 の UMP 化。一連のタンパク質基質（ウシ血清アルブミン、MBP-lacZα、ORF1a によってコードされる C 末端 His6 で標識された一連の HCoV-229E nsps を含む）を使用して、HCoV-229E nsp12-His6+ 媒介の UMP 化活性を評価しました。タンパク質。材料と方法に記載されているように、nsp12 の非存在下 (A) または存在下 (B) でタンパク質を [α-32P] UTP と 10 分間インキュベートします。A と B の上部にはクマシー ブリリアント ブルーで染色した SDS ポリアクリルアミドゲルが示されており、A と B の下部には対応するオートラジオグラムが示されています。タンパク質分子量マーカーの位置 (キロダルトン単位) が左側に示されています。nsp12-His6 の位置 (B、上)、および nsp12-His6 と nsp9-His6 のインキュベーション中に観察された放射性シグナル (B、レーン 7) も示されており、これは [α-32P]UMP が nsp9-His6 に結合していることを示しています。 (12.9 kDa)、これは試験した他のタンパク質では観察されませんでした。
HCoV-229E NiRAN を介した nsp9 NMP 化の生化学的およびウイルス学的特性評価。(A および B) 反応に使用されるヌクレオチド共基質の役割。標準的な NMP 化アッセイでは、Nsp12-His6 と nsp9-His6 を混合し、さまざまな [α-32P] NTP の存在下でインキュベートします。(A、上) SDS-PAGE で分離されたクーマシー染色された nsp9-His6。(A、下) ゲルの同じ領域のオートラジオグラフ。(B) 指定されたヌクレオチド補因子の存在下での相対活性 (平均 ± SEM) は、3 つの独立した実験から決定されます。*P≤0.05。(C) 金属イオンの役割。それぞれ濃度 1 mM の [α-32P] UTP およびさまざまな金属イオンの存在下での標準的な NMP 化テストを示します。上部のCでは、クーマシー染色したnsp9-His6を示し、下部のCでは、対応するオートラジオグラフィーを示します。標識タンパク質のサイズ (キロダルトン) は A および C の左側に示されています。 (D) 指定されたアミノ酸置換を持つ HCoV-229E nsp12-His6 の変異型は、記載されているように [α-32P]UTP にあります。材料と方法で。NMP化反応で生成された放射性標識nsp9-His6は、リン酸化イメージングによって検出されます(D、上)。野生型（wt）タンパク質と比較した相対活性をDに示し、下は3回の独立した実験からの平均（±SEM）とした。アスタリスクは、非保存残基の置換を示します。(E) 感染から24時間後に得られたp1細胞の培養上清中のウイルス力価をプラークアッセイにより測定した。操作された HCoV-229E 変異体の NiRAN ドメイン内のコドン置換が示されています (残基の番号付けは pp1ab 内の位置に基づいています)。複製欠損 RdRp 活性部位変異体 nsp12_DD4823/4AA をコントロールとして使用しました。
NiRAN の活性部位をより深く理解し、nsp9 特異的 NMP トランスフェラーゼの活性に関連する残基を決定するために、NiRAN の AN、BN、および CN モチーフの保存的残基を置換する変異解析を実行しました ( 16) それは Ala (SI 付録、図 S2) です。さらに、保存的な Arg から Lys または Lys から Arg への置換の影響を 2 つのケースで評価しました。(ネガティブ) コントロールとして、コロナウイルスやその他の入れ子ウイルスの NiRAN ドメインで保存されていないか保存度が低い残基が Ala に置換されます。K4116A (モチーフ preAN)、K4135A (AN)、R4178A (BN)、D4188A (モチーフの置換) BN) および D4280A (CN) は、nsp12 を介して nsp9 の NMP 化を大幅に減少させるか、さらには排除しますが、保存的置換を有するタンパク質 (R4178K) 、K4116R) は活性の 60% および 80% を保持します。これは、それぞれの側の制限が緩和されることを示しています。鎖は物理化学的に敏感です (図 3D)。他のいくつかの保存された残基 E4145A、D4273A、F4281A、および D4283A を置換することは有害性がはるかに低く、nsp9 の UMP 化は中程度しか減少しません。他の NTP を含む nsp9 NMP 化反応でも同様の結果が得られ (図 3D および SI 付録、図 S3)、特定のアミノ酸置換に対する観察された効果は、使用したヌクレオチド共基質の種類に依存しないことが確認されました。次に、細胞培養におけるコロナウイルスの複製に対するこれらの nsp12 置換の考えられる影響をテストしました。この目的を達成するために、本発明者らは、組換えワクシニアウイルスでクローン化された適切な遺伝子操作された相補的 DNA (cDNA) テンプレートを使用し (23、24)、5 ～ 7 個の細胞を転写した。これらの細胞で産生された感染性ウイルス子孫の力価測定により、ほとんどの HCoV-229E NiRAN 変異体は実行不可能であることが示されました (図 3E)。生存不能なウイルス変異体のグループには、in vitro で NMP トランスフェラーゼ活性を排除または大幅に低下させることが示されている代替ウイルス (K4116A、K4135A、R4178A、D4188A、D4280A、D4283A) が含まれていますが、他にも 2 つの代替ウイルス (K4116R、E4145A) があります 80 ％ 予約済み？これらの in vitro NMP 化活性は、追加の制限が関与していることを示唆しています。同様に、NiRAN の in vitro NMP 化活性の中程度の低下を引き起こす他の 2 つの変異 (R4178K、F4281A) は生きたウイルスを生成しましたが、これらのウイルスは複製を通じて力価を大幅に低下させました。図 3D に示す in vitro 活性データと一致し、コロナウイルスおよび/または他の入れ子ウイルス (K4113A、D4180A、D4197A、D4273A) (8、16) で保存されていない他の 4 つの残基を置き換えると、生存可能なウイルスが生成されました。野生型ウイルスと比較して力価は中程度に低下しました（図 3E）。
NiRAN 媒介 NMP トランスフェラーゼ活性が活性 RdRp ドメインに依存するかどうかを研究するために、RdRp モチーフ C の二価金属イオン (11) の配位に関与する 2 つの保存された Asp 残基が Ala に置き換えられました。得られたタンパク質 nsp12_DD4823/4AA は、この nsp9 NMP 化活性は、nsp12 媒介の in vitro nsp9 NMP 化活性がポリメラーゼ活性を必要としないことを示しています (SI 付録、図 S4)。
nsp12 に対する nsp9 特異的な NMP トランスフェラーゼ活性を確立した後、質量分析 (MS) によって NMP-nsp9 付加物の特性評価を試みました。組換え HCoV-229E nsp9 の完全なタンパク質質量スペクトルは、12,045 Da にピークを示しました (図 4A)。nsp12 を添加しても nsp9 の品質は変化しませんでした。これは、nsp12 と nsp9 が使用条件 (変性) の下で安定した複合体を形成しないことを示しています (図 4A)。UTP および GTP の存在下で、nsp9 および nsp12 を含む反応の質量測定により、UTP のタンパク質質量が 306 Da 移動し、GTP のタンパク質質量が 345 Da 移動することが示されました。これは、各 nsp9 分子が UMP または GMP に結合することを示しています。 (写真4)CとD)。NiRAN を介した nsp9 の NMP 化に必要なエネルギーは、NTP の加水分解とピロリン酸の放出に由来すると推測されています。この反応では、nsp12 (酵素) よりも 10 倍モル過剰の nsp9 (標的) が使用されましたが、nsp9 のほぼ完全な NMP 化が観察され、nsp12 と nsp9 の間の相互作用は短命であり、nsp12 がより多くの nsp9 を NMP 化できることが示されました。インビトロ分子。
nsp12 および UTP または GTP の存在下での nsp9 の単一 NMP 化。HCoV-229E nsp9 のデコンボリューションされた完全なタンパク質質量スペクトル (SI 付録、表 S1) (AD) を示します。(A) nsp9 単独、(B) nsp9 + nsp12-His6、(C) UTP 存在下での nsp9 + nsp12-His6、(D) GTP 存在下での nsp9 + nsp12-His6。
nsp12 によって UMP 化された nsp9 残基を決定するために、nsp9-UMP をトリプシンで切断しました。得られたペプチドはナノ高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で分離され、オンラインのタンデム質量分析 (MS/MS) で分析されました。Byonic ソフトウェア パッケージ (Protein Metrics) を使用したデータ分析により、N 末端アミノ酸の UMP 化が示されました。これは手動で確認されます。前駆体ペプチド [UMP]NNEIMPGK のタンデム質量スペクトル (SI 付録、図 S5A) から 421 m/z のフラグメントが明らかになり、UMP が nsp9 の残基 1 に結合することが示されました。
nsp9 の N 末端では、Asn はオルソコロナビリン亜科のメンバー間で保存されています (SI 付録、図 S6)。我々は、N末端の第一級アミン窒素がUMPのアクセプターである可能性が最も高いと考えていますが、N末端でのNMP結合の追加の証拠を入手することにしました。このため、HPLC によって精製された非 NMP 化および NMP 化 N 末端ペプチド nsp9 は、アセトンおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で誘導されました。これらの条件下では、遊離の第一級アミンのみがプロピル (25) で修飾できます。配列 NNEIMPGK を持つ N 末端 nsp9 由来ペプチドは、2 つの一級アミンを含み、1 つは Asn の N 末端に、もう 1 つは C 末端の Lys 側鎖にあります。そのため、両末端にプロピル基を導入することが可能です。非 NMP 化ペプチドの抽出イオンクロマトグラムは、SI 付録の図 S5B に示されています。予想どおり、N 末端および C 末端（モノ）プロピル化ペプチド（SI 付録、図 S5B、上のレーン）およびジプロピル化ペプチド（SI 付録、図 S5B、下のレーン）を同定できます。このパターンは、nsp9 の NMP 化 N 末端ペプチドを使用すると変化します。この場合、C 末端のプロピル化ペプチドのみが同定できますが、N 末端のプロピル化ペプチドとジプロピル化ペプチドは同定されません (SI 付録、図 S5C)。これは、UMP が N 末端の第一級アミンに転移していることを示しています。グループが変更を加えないようにします。
次に、nsp9 の N 末端にある保存された残基を (Ala または Ser で) 置換または削除して、標的固有の制約を定義します。NiRAN が nsp9 の N 末端残基の第一級アミンと nsp9-NMP 付加物を形成することを示す MS データに基づいて、nsp9 の NMP 化にはウイルスのマスター プロテアーゼ (Mpro、nsp5) が nsp9 の N 末端を遊離する必要があるという仮説を立てました。そのポリタンパク質前駆体。この仮説を検証するために、大腸菌で nsp9 を含む前駆体タンパク質 nsp7-11 を生成し、[α-32P] UTP の存在下で標準的な NMP 化テストを実行しました (材料と方法)。図 5A (レーン 3) に示すように、切断されていない nsp7-11 前駆体は nsp12 で放射性標識されていません。対照的に、nsp7-11 が組換え nsp5 によって切断されて前駆体から nsp9 (および他の nsps) が放出される場合、nsp9 とともに移動する放射性標識タンパク質が検出され、NiRAN と N-選択的共有結合 nsp9-NMP 付加物の形成という我々の結論が裏付けられます。 。N 末端 Asn の末端第一級アミン (pp1a/pp1ab の 3825 位)。この結論は、N 末端に 1 つまたは 2 つの追加残基を含む nsp9 構築物を使用した実験によっても裏付けられています。どちらの場合も、NiRAN を介した nsp9 の UMP 化は廃止されました (SI 付録、図 S7)。次に、nsp9 の N 末端の 3825-NNEIMPK-3832 ペプチド配列から 1 つまたは 2 つの Asn 残基が欠失したタンパク質を作製しました。どちらの場合も、nsp9 の UMP 化は完全にブロックされ (図 5B)、実際の nsp9 N 末端が NMP 受容体として機能するというさらなる証拠が得られました。
nsp9 のタンパク質分解プロセシングと nsp12 媒介 UMP 化における N 末端残基の役割。(A) nsp9 UMP 化には遊離の nsp9 N 末端が必要です。Nsp7-11-His6 は、組換え Mpro (nsp5-His6) の存在下または非存在下で、UTP を含む NMP 化検出バッファー中で 30 °C でプレインキュベートされます。3 時間後、「材料と方法」に記載されているように、nsp12-His6 を添加して NMPylation アッセイを開始します。nsp5-His6 (レーン 1) および nsp9-His6 (レーン 2) を含む反応をコントロールとして使用しました。10分後、反応を終了し、反応混合物をSDS-PAGEで分離した。タンパク質をクーマシー ブリリアント ブルーで染色しました (A、上)。Nsp7-11-His6 前駆体および nsp5-His6 媒介切断から生じる処理産物を右側に示します。(サイズが小さいため) nsp7 および nsp11-His6 はこのゲルでは検出できず、反応には nsp5-His6 が追加されていることに注意してください (レーン 1 および 4; nsp5-His6 の位置は黒丸で示されています)。または nsp9-His6 (レーン 2) は、MBP 融合タンパク質として発現されるため、残留不純物として少量の MBP (白丸で示す) を含みます (SI 付録、表 S1)。(B) Nsp9-His6 バリアントは 1 つまたは 2 つの N 末端 Asn 残基 (pp1a/pp1ab の位置に応じた残基番号付け) を欠いており、精製され、nsp12-His6 および [α-32P] UTP とともにインキュベートされます。B、クーマシーで染色した SDS-PAGE を上部に示し、B、対応するオートラジオグラフを下部に示します。分子量マーカーの位置 (キロダルトン単位) を左側に示します。(C) HCoV-229E nsp9-His6 N 末端保存残基を Ala または Ser で置換し、nsp12-His6 媒介 UMP 化反応に同量のタンパク質を使用しました。反応生成物をSDS-PAGEで分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色し(C、上)、放射性標識nsp9-His6を燐光イメージングによって検出した(C、中)。野生型 (wt) タンパク質を参照 (100% に設定) として使用し、相対的な NMP 化活性 (平均 ± SEM) を 3 つの独立した実験から計算しました。（D）HCoV-229E野生型Huh-7細胞に感染したHuh-7細胞、およびnsp9に指定されたアミノ酸置換を有する変異体のp1細胞培養上清中のウイルス力価をプラークアッセイにより測定した。複製欠損 RdRp モチーフ C 二重変異体 DD4823/4AA をネガティブコントロールとして使用しました。
nsp9 の N 末端 (特に 1、2、3、および 6 位) は、オルソコロナビリン亜科のメンバー間で非常に保存されています (SI 付録、図 S6)。nsp12媒介nsp9 NMP化におけるこれらの残基の考えられる役割を研究するために、nsp9のN末端にある2つの連続するAsn残基をAlaまたはSer（単独または組み合わせ）で置換した。野生型 nsp9 と比較して、N3825 を Ala または Ser で置換すると、nsp12 媒介の UMP 化が 2 倍以上減少しました (図 5C)。NMP化がN末端残基の側鎖ではなくN末端第一級アミンで起こるという我々の結論と一致して、N3825AとN3825Sの置換による顕著な残留NMP化が観察されました。興味深いことに、2 番目の Asn が Ala または Ser で置換されると、nsp9 の UMP 化はより強く (10 分の 1 以上) 減少しますが、3、4、および 6 位の Ala の置換は nsp9 の UMP 化に中程度の影響しか与えません (図 2)。 ）。5C）。ATP、CTP、または GTP を使用しても同様の結果が得られました (SI 付録、図 S8)。まとめると、これらのデータは、nsp9 の NMP 化における N2826 (nsp9 の 2 位) の重要な役割を示しています。
nsp9 の N 末端と NMP 化の間の機能的相関関係のさらなる証拠を得るために、コロナウイルスファミリーの nsp9 配列 (104 ～ 113 残基の間で変化する) の多重配列アラインメント (MSA) を実行しました (SI 付録、図S6）。さまざまな哺乳類、鳥類、爬虫類の宿主に感染するオルソコロナヴィリナ亜科の 5 属の合計 47 種 (既知および推定) において、不変であることが判明したのは合計 8 残基のみでした。以前の構造研究によって決定されたように、欠失および挿入を含む最も広範な変化は、nsp9 の二次構造要素間のサイクルで観察されました (26 ??28)。nsp9 の C 末端部分の β 鎖と α ヘリックスに 5 つの不変残基が見つかりました。3 つの不変残基が nsp9 の N 末端の NNE モチーフを構成します。このモチーフの2番目のAsnは唯一の不変残基であり、遠縁のカエルコロナウイルスの仮説nsp9にも共有されており、アルファレトウイルスのレトウイルス亜科のミクロヒラレトウイルス1種を表すことが明らかになった。nsp9 二次構造要素の残基の保存は、フォールディングまたは既知の RNA 結合特性を維持するための構造的考慮によって合理化できます。しかし、この推論は NNE の保存には当てはまらないようであり、この研究以前には、トリペプチド配列の変動を制限する制約の性質は完全に不明瞭でした。
コロナウイルス複製におけるnsp9-NMP化とNNE保存の重要性を決定するために、我々はnsp9 N末端残基の単一または二重置換を有するHCoV-229E変異体を作製した。これは、nsp9 NMP化がin vitroで有害であることを示している。始める前に、これらの置換 (nsp8|9 切断部位近く) が C 末端 pp1a 領域のタンパク質分解プロセシングに影響を与えるかどうかという質問に答えようとします。nsp9 の N 末端に対応する置換を含む一連の nsp7-11 ポリタンパク質構築物を大腸菌で生成し、組換え Mpro で切断しました。4 つの部位 (nsp9 隣接部位を含む) のタンパク質分解的切断は、Mpro 媒介の nsp8|9 切断を妨げるこれらのタンパク質の構造変化を除いて、導入された置換によって大きな影響を受けません (SI 付録、図 S9)。 Webサイト。
Huh-7 細胞に、nsp9 N 末端の保存された NNE トリペプチド (N3825、N3826、および E3827) の Ala または Ser 置換をコードするゲノム長の HCoV-229E RNA をトランスフェクトしたところ、ほとんどの変異が致死的であることが示されました。N末端Asn（N2835AまたはN2835S）のSerまたはAlaを置換することでウイルスをレスキューすることはできましたが、NNE配列の他の単一および二重変異（N3826A、N3826S、NN3825/6AA、 NN3825/6SS)、E3827A) (図 5D)。
これらの結果は、組織培養におけるコロナウイルスの複製が制限され（同一または類似）、体内のnsp9 NMP化部位の自然変異が制限され、コロナウイルスの生活環におけるこの反応の重要な役割を裏付けることを示しています。
最後の実験セットでは、C 末端 His6 標識 SARS-CoV-2 nsp12 および nsp9、および nsp12 の 2 つの変異型を大腸菌で生成しました。NiRAN および RdRp ドメインの活性部位残基はそれぞれ、代わりに Ala を使用しました (図 6A および SI 付録、表 S2)。SARS-CoV-2 nsp12 の K4465 は、HCoV-229E の K4135 に対応し (SI 付録、図 S2)、これは NiRAN 活性と HCoV-229E 複製に必要であることが判明しました (図 3D および E)。この残基は、動脈ウイルス EAV nsp9 K94 残基にも対応し、これは NiRAN の自己 UMP 化/自己 GMP 化に必要であることが以前に示されています (16)。図6Bに示すように、SARS-CoV-2 nsp12は、基質としてnsp9を使用するUMPトランスフェラーゼ活性を有するが、nsp12_K4465A活性部位変異体は不活性である。RdRpモチーフCのSDD特徴的配列における二重置換はUMPトランスフェラーゼ活性に影響を及ぼさず(図6B)、これはRdRp活性がnsp9のUMP化に直接的な影響を及ぼさないことを示している。CTP、GTP、ATP を使用しても同様のデータが得られました (SI 付録、図 S10)。要約すると、これらのデータは、NiRAN 媒介の nsp9 NMP 化が、オルソコロナウイルス サブファミリーのさまざまな属を代表するコロナウイルスにおいて保存的活性を有することを示しています。
SARS-CoV-2 nsp12 による nsp9 の NMP 化。(A) NMP 化テストで使用した組換えタンパク質を示すクマシー染色 SDS ポリアクリルアミドゲル。対照として、SARS-CoV-2 nsp12のNiRANドメイン（K4465A）およびRdRpドメイン（DD5152/3AA）の活性部位置換を有する変異タンパク質を使用した。残基の番号付けは、pp1ab 内の位置に基づいています。(B) nsp12-His6 (野生型 [wt] および変異体) の基質として nsp9-His6 および [α-32P]UTP を使用した UMP 化検出のオートラジオグラフ。標識タンパク質の分子量 (キロダルトン) を左側に示します。
NiRAN ドメインは一般にニドウイルス目で保存されており (16)、これらのドメインがニドウイルスの複製に不可欠な酵素反応を触媒していることが示されています。この研究では、コロナウイルスの NiRAN ドメインが NMP (NTP から生成) を、ウイルス複製に関与する謎の RNA 結合タンパク質である nsp9 (26 ?? 29) に転移させ、それを天然の標的として決定し、コロナウイルスRTCのパートナー。
NiRAN ドメインは 3 つの配列モチーフ (AN、BN、CN) を共有しており、これらは単系統だが高度に分化したニドウイルス目のすべてのファミリーで保存されている非常に少数の残基を含んでいます (8, 16)。最近の研究では、それらは、元々は SelO ファミリーと呼ばれていた、ほとんど特徴づけられていないプロテインキナーゼ様タンパク質のファミリーに構造的に関連していることが示されています (17、19、22、30、31)。SelO 関連タンパク質はキナーゼフォールドを持っていますが、古典的なキナーゼのいくつかの保存された活性部位残基が欠如しています (22、32)。活性部位に結合し、特異的相互作用によって安定化される ATP 分子の逆配向に基づいて、SelO は仮説が立てられ、その後 AMP (リン酸の代わりに) をタンパク質基質に輸送することが確認されました (22)。一方、別の細菌の SelO 様タンパク質 YdiU は、最近、異なるタンパク質基質の Tyr および His 残基への UMP の共有結合を触媒することが示されました (33)。
コロナウイルス NiRAN ドメインの推定活性部位残基の予測を確認および拡張するために、生化学および逆遺伝学手法を使用して、コロナウイルス nsp12 の変異分析を実行しました (図 3D、E、SI 付録、図 S3 および表) S1â S4)。データは、HCoV-229E K4135、R4178、および D4280 を Ala に置換すると、in vitro NMP トランスフェラーゼ活性と細胞培養におけるウイルス複製が排除されることを示し (図 3D、E、および SI 付録、図 S3)、NTP γ-リン酸におけるそれらの存在を裏付けています。 (K4135、R4178) および活性部位金属イオンの配位 (D4280)。K4135 (17) 位置を安定化すると予測されるツバメの巣ウイルスの範囲内の保存された Glu の E4145A 置換は、ウイルス複製を排除することが示されましたが、驚くべきことに、その活性は in vitro NMP 化アッセイで保持されました (図 3D および E、 SI 付録、図 S3 および表 S1 ～ S4)。対応する置換がネズミチフス菌の YdiU ホモログ (E130A) に導入された場合にも、同様の観察が行われました (33)。総合すると、これらのデータは、触媒機能ではなく、この保存された残基の調節機能を裏付けています。
HCoV-229E NiRAN ドメイン内のネストウイルスの範囲内で保存された Phe 残基 (F4281A) を置換すると (8)、in vitro での NMP 化活性が低下し、細胞培養でのウイルス複製が大幅に減少しました (図 3D、E、SI)。付録、図 S3)。このデータは、以前に示した相同な DFG モチーフ Phe 残基など、この残基の重要な調節機能と一致しています。古典的なプロテインキナーゼでは、これは Mg2+ 結合ループの一部であり、脊椎の組み立てと調節に役立ちます。??効果的な触媒活性に必要です (32, 34)。K4116 残基 (preAN モチーフ内) をそれぞれ Ala と Arg に置換すると、ウイルス複製が排除され、予想通り、導入されたアミノ酸側鎖に応じて、in vitro での NMP トランスフェラーゼ活性に異なる影響を及ぼしました (図 3D、E、および SI 付録) 、図S3)。機能データは構造情報と一致しており、この残基が ATP リン酸との相互作用を確立していることを示しています (17)。他のネステッドウイルスファミリーの NiRAN ドメインでは、HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 の位置は Lys、Arg、または His によって占められており (8)、この特定の残基の機能制限が緩和されていることを示しています。D4188A および D4283A を置換すると、酵素活性が消失または大幅に低下し、ウイルスの複製が消失します (図 3)。これら 2 つの残基は、ほとんど (すべてではない) 入れ子ウイルスで保存されており (8)、これは重要なファミリー特異的ではあるが、おそらく非触媒機能であることを示しています。コロナウイルス科または他のネスチオウイルス科で保存されていない他のいくつかの Lys および Asp 残基 (K4113A、D4180A、D4197A、および D4273A) の Ala 置換 (8) を対照として使用しました。予想通り、これらの置換はほとんど許容可能ですが、場合によっては酵素活性とウイルス複製がわずかに低下します（図 3 および SI 付録、図 S3）。全体として、コロナウイルス変異誘発データは、EAV NiRAN-RdRp の自己 GMP および逆遺伝学データと非常に一致しており (16)、EAV nsp9 (コロナウイルス nsp12 オルソログ) 残基 K94 (HCoV-229E K4135 に対応) が重要な機能を果たしています。 R124（R4178に相当）、D132（D4188に相当）、D165（D4280に相当）、F166（F4281に相当）。さらに、HCoV-229E 変異誘発データは、以前に報告された SARS-CoV 逆遺伝学データ (16) と一致し、それを拡張したものであり、対応する CN モチーフ Phe-to-Ala 変異体 SARS-CoV_nsp12 で観察されたものと非常によく似ています。表現型は、-F219A および HCoV-229E_F4281A を示しました (図 3 D、E、および SI 付録、図 S3 および表 S1～S4)。
（自己 NMP 化反応において）UTP および GTP を明らかに優先する EAV オルソログ (16) と比較して、我々の研究は、コロナウイルス NiRAN ドメイン (HCoV-229E および SARS-CoV-2 に代表される) が効果的に作用できることを示しています。 4 つの NMP すべてが転送されましたが、UMP がわずかに優先されます (図 1 および 3)。特定の NTP 共基質の特異性が比較的低いことは、最近報告された SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 スーパー複合構造と一致しており、ADP-Mg2+ は NiRAN の活性部位に結合するが、アデニンには結合しない特定の相互作用の形成について説明します (17)。私たちの研究では、NMP化反応で使用されるヌクレオチドの種類は、変異タンパク質の活性に差次的な影響を及ぼさず（SI付録、図S3）、これらの残基のいずれも特定の核酸塩基の結合と密接に関連していないことを示しています。コロナウイルスと動脈ウイルスの NiRAN ドメインで観察されるさまざまな NTP 共基質選択の構造的基礎と潜在的な生物学的重要性は、まだ研究されていません。それらは真実である可能性もあれば、それぞれの研究の限界によるものである可能性もあります。現時点では、動脈ウイルスとコロナウイルスの類似性を考慮すると、動脈ウイルス NiRAN ドメインの潜在的な NMP 化活性が（以前に特徴付けられた自己 NMP 化活性と比較して）異なる共基質優先性を持っていることを除外することはできません。 NiRAN ドメインは限界に達しています。シーケンスベースの比較 (16)。Mg2+ を補因子として使用するシュードキナーゼ SelO と比較して、コロナウイルスおよび動脈ウイルス NiRAN の活性は Mn2+ に依存します (16) (図 3C および SI 付録、図 S1)。Mn2+ 依存性と UTP に対する明らかな優先性は、タンパク質 NMPylator の珍しい特徴であり、最近になってネズミチフス菌の YdiU タンパク質でも確認されました。このタンパク質は、細胞をストレス誘導から保護するための厳密な Mn2+ 依存性タンパク質シャペロン UMPylation を触媒します。細胞 ATP プール ( 33）。
最近報告されたコロナウイルス NiRAN ドメインと細胞プロテインキナーゼ間の構造的類似性 (17、19) は、NMP をこの研究で報告した他のタンパク質に共有結合する NiRAN の能力をさらに裏付けるものとなります。私たちは、RTC の ORF1b にコードされたレプリカーゼを直接的または間接的に支援することが知られている、HCoV-229E ORF1a によってコードされるタンパク質上の可能性のある NiRAN ターゲットの探索に焦点を当てました (12、35)。私たちの実験は、nsp9 の効果的かつ特異的な NMP 化に関する決定的な証拠を提供します (図 2)。標的タンパク質を酵素（nsp12）の 8 ～ 10 倍モル過剰で使用すると、nsp9 が完全に（モノ）NMP 化されることが確認されます（図 4）。我々は、nsp12とnsp9の間の相互作用は短命であり、(他のRTCサブユニットが存在しない場合には)nsp9と安定した複合体を形成しないと結論付けた。この結論は、SARS-CoV プロテオームに関するタンパク質相互作用研究によって裏付けられています (35)。MS分析により、nsp9のN末端残基の一級アミンがNMP化部位として同定されました（SI付録、図S5）。ホスホルアミデート結合と N 末端アミノ基の形成により、NiRAN 媒介 NMP 化活性と、Ser、Thr、または Tyr 残基での O 結合型 AMP の形成を触媒する Pseudomonas syringae SelO 媒介 AMP 化反応と区別されます。 22)、S. typhimurium YdiUは、O結合型(Tyrと)およびN結合型(Hisと)のペプチドUMP付加物を形成します。SelO ファミリーのタンパク質に関して入手可能な情報は限られていますが、この大きなタンパク質ファミリーのメンバーはペプチドと NMP 付加体の形成において大きく異なることが示されています。これはさらなる研究に値する興味深い観察です。
この研究で得られたデータから、nsp9 の NMP 化には遊離 N 末端が必要であるという仮説が立てられました。ウイルス複製の文脈では、これは、Mpro および pp1ab によって媒介されるレプリカーゼ ポリタンパク質 pp1a の nsp8|nsp9 プロセシング部位のタンパク質分解的切断によって提供されます。ほとんどのコロナウイルスでは、この特定の部位 (HCoV-229E では VKLQ|NNEI) と他のすべてのコロナウイルス Mpro 切断部位の違いは、Asn (Ala、Ser、Gly などの別の小さな残基ではなく) が P1â? を占めていることです。??場所 (36)。初期の研究で得られたペプチド切断データは、nsp8|nsp9 部位の切断効率が他の部位よりも低いことを示し、1) この特定の部位が C 末端の適時に調整されたプロセシングにおいて調節的役割を果たしている可能性があることを示しています。 pp1a 領域、または 2) a ウイルス複製における特別に保存された nsp9 N 末端の役割 (37)。我々のデータ (図 5A) は、実際の N 末端配列を持つ nsp9 の組換え型が nsp12 によって効果的に NMP 化されたことを示しました。N 末端隣接配列は、Xa 因子 (nsp9-His6; SI 付録、表 S1) または Mpro 媒介切断 (nsp7-11-His6; 図 5A および SI 付録、表 S1) によって除去されました。重要なことに、切断されていない nsp9 含有前駆体 nsp7-11-His6 は、nsp12 の NMP 化に対する耐性を示しました。これは私たちのデータと一致しており、nsp9-NMP 付加体が N 末端第一級アミンを介して形成されることを示しています (SI 付録、図 S5)。 。NiRAN の基質特異性をより深く理解するために、nsp9 の隣接する N 末端残基に焦点を当てました。他のタンパク質が存在しない場合、それらは構造的に柔軟であり、標識されていない形態の nsp9 (26 28, 38) では検出されず、天然の変異が限られていることを示しています。これは重要な配列特異的 (二次構造関連ではない) によるものです。 nsp9 N末端フラグメントの機能。この領域の保存残基の Ala 置換 (図 5C および D および SI 付録、図 S8) は、N3826 が in vitro での nsp9 の NMP 化に必須であり、N3825A および E3827A 置換は NMP 化の減少につながる一方、M3829A および P3830A 置換は減少しないことを明らかにしています。 。明らかにnsp9のNMP化に影響します。N 末端 Asn の置換 (N3825A、N3825S) は、細胞培養における nsp9 の NMP 化とウイルス複製に中程度の影響しか与えませんが (図 5C および D)、N 末端 3825-NN ジペプチドからの Asn 残基配列の欠失これは、ウイルスにとって致死的であることが証明されており、N 末端の別の残基、好ましくは Asn の前に 1 つの Asn 残基が必要であることを示していますが、同様の残基の置換は部分的に許容できるようです (図 5B、C、および D)。我々は、3825-NNジペプチド、特にコロナウイルス範囲内の保存された必須のN3826残基（SI付録、図S6）が、NiRANの活性部位におけるnsp9 N末端の正しい結合と配向を保証すると結論付けています。
すべてのサブファミリーの保存された Glu を Ala (E3827A) に置換すると、in vitro では nsp9 の NMP 化が保持されますが、細胞培養ではウイルスに対して致死的になります (図 5C および D)。これは、この残基が、たとえば重要な相互作用 (NMP 化または未修飾) において追加の機能を発揮することを示しています。 ) nsp9 N 末端およびウイルス複製に関与するその他の因子。Nsp9 変異は、nsp9 または隣接する nsps のタンパク質分解プロセスに影響を与えませんでした (39) (SI 付録、図 S9)。これは、観察されたいくつかの nsp9 変異の致死表現型が、C タンパク質分解プロセス末端 pp1a 領域の調節不全によって引き起こされたものではないことを示しています。 。
上記のデータは、pp1a/pp1ab の nsp8|9 切断部位の Mpro 媒介処理後、nsp9 の N 末端が UMP 化される (または別の NMP で部分的に修飾される) 可能性があるという証拠を提供します。さらに、nsp9 の N 末端（コロナウイルスファミリーの単一かつ不変の Asn 残基を含む）の優れた保存と、この研究で得られた逆遺伝学データ（図 3E および 5D）により、記載されている nsp9 の NMP 化が正常に行われているとの結論に至りました。生物学的に関連しており、コロナウイルスの複製に不可欠です。この修飾の機能的影響は、例えば、以前に記載された（非特異的）nsp9（未修飾型）RNA結合活性に関して、まだ研究されていない（2628）。N 末端の NMP 化は、nsp9 とタンパク質または RNA 基質との相互作用、または異なる 4 レベル集合体の形成にも影響を与える可能性があります。これらは構造研究で観察されており、コロナウイルスの複製に機能的に関連していることが確認されていますが、特にこの修飾の場合はそうではありません (26-–29, 40)。
コロナウイルス NiRAN ドメインの標的特異性はさらに詳細に特徴付ける必要がありますが、我々のデータは、コロナウイルス NiRAN ドメインのタンパク質標的特異性が非常に狭いことを示しています。すべてのニドウイルスファミリーの NiRAN ドメインにおける主要な活性部位残基 (8、16) の保存は、これらのタンパク質の保存された NMPylator の活性を強力に裏付けていますが、このドメインの基質結合ポケット残基の正体はまだ解明されていません。 、ニドウイルス目の目的は科によって異なる場合があります。同様に、他の入れ子ウイルスの関連ターゲットはまだ決定されていません。Mpro と NiRAN の間のゲノム配列を含め、入れ子ウイルスで一般に保存されている 5 つのレプリカーゼ ドメインの外側の配列はあまり保存されていないため、これらは nsp9 または他のタンパク質の遠隔オルソログである可能性があります (8)。その中で、nsp9 はコロナウイルス。
さらに、現時点では、NiRAN ドメインに追加の (セルラーを含む) ターゲットがある可能性を排除できません。この場合、この新興タンパク質 NMPylators (NMPylators) (30, 31) の細菌相同体が「マスター制御因子」を持っているように見えることは言及する価値があります。NMP は、さまざまな細胞タンパク質を調節してその下流の活性を調節または排除し、それによって細胞のストレス応答や酸化還元ホメオスタシスなどのさまざまな生物学的プロセスにおいて役割を果たします (22、33)。
この研究 (図 2 および 4、および SI 付録、図 S3 および S5) では、nsp12 が UMP (NMP) 部分を nsp9 の単一の (保存された) 位置に転移する一方、他のタンパク質は修飾されていないことを証明することができました。この条件下では、（緩やかではなく）明確に定義された基質特異性がサポートされます。これと一致して、N末端nsp9のNMP化と比較して、nsp12自身のNMP化活性は非常に低く、その検出にはより長いオートラジオグラフィー露光時間が必要であり、nsp12濃度の10倍の増加が使用される。さらに、我々の MS 分析は nsp12 の NMP 化の証拠を提供できませんでした。これは、NiRAN ドメインの自己 NMP 化が (せいぜい) 二次的な活動であることを示唆しています。ただし、他の研究により、細菌の NMPylator の自己 AMP 化状態が他のタンパク質基質に対する NMPylation 活性を制御する可能性があるという予備的な証拠が提供されていることに注意する必要があります (22、33)。したがって、EAV nsp9 (16) およびコロナウイルス nsp12 (この研究) について報告されている自己 NMP 化活性の機能的影響の可能性を調査するには、C 末端 RdRp ドメインの折り畳みに対するシャペロン様効果の提案を含め、さらなる研究が必要です ( 16））。
これまで、RNAリガーゼ、RNAキャップグアニル酸トランスフェラーゼ、タンパク質プライミング活性など、ニドウイルスNiRANドメインの下流機能の可能性に関するいくつかの仮説が検討されてきたが(16)、それらのどれも利用可能な下流機能と一致しない。以下の位置で得られる情報は、追加の仮定を行わずにまったく同じ時刻です。この研究で得られたデータは、NiRAN ドメインがタンパク質誘導性 RNA 合成の開始に関与しているということと最も一致しています (ただし証明はできません)。以前は、NiRAN ドメインの機能は 5?? にあると考えられていました。²-RNA キャッピングまたは RNA ライゲーション反応は、これらおよび他のデータのサポートの影響を受けません。したがって、例えば、NiRAN の活性部位には、一般的な塩基として保存された Asp が関与していると考えられます (シュードモナス・シリンガエ SelO では D252、HCoV-229E pp1ab では D4271、SARS-CoV-2 nsp12 では D208) (SI 付録、図 2) ）。S2) (17、22、33)、一方、ATP 依存性 RNA リガーゼおよび RNA キャッピング酵素における触媒作用は、非変化 Lys 残基を含む共有結合酵素-(リシル-N)-NMP 中間体によって実行されます ( 41）。さらに、保存されたタンパク質標的に対するコロナウイルス NiRAN の配列ベースの顕著な特異性と、NTP 共基質（UTP を好む）に対する緩やかな特異性が、NiRAN 媒介キャッピング酵素または RNA リガーゼ様機能に対抗します。
明らかに、タンパク質誘導性 RNA 合成における nsp9-UMP (nsp9-NMP) の役割を検証し、証明された場合は詳しく説明するには多くの追加の研究が必要であり、これにより、以前に報告されたいくつかの興味深いが (これまでの) 報告が結び付けられることになります。 。孤立した観察。例えば、コロナウイルスのマイナス鎖 RNA の末端はオリゴ (U) 鎖で始まることが判明しています (42, 43)。この観察は、マイナス鎖 RNA の合成は、nsp9 の UMP 化型がポリ (A) テールに結合することによって開始され (トリガー)、その RNA 結合活性および/または相互作用によって促進される可能性があるという考えと一致しています。別のRTCタンパク質。nsp9 によって提供される UMP 部分は、ゲノム RNA または別のオリゴ (A) 含有配列の 3??2-ポリ(A) テールを使用して、nsp7/8/nsp12 媒介オリゴウリジル化の「プライマー」として使用できます。ピコルナウイルス VPg タンパク質で確立されたメカニズムと同様に、鋳型として機能します (44)。提案が「非規範的」な場合はどうなるでしょうか????（タンパク質誘導性の）マイナス鎖RNA合成の開始は、コロナウイルスのマイナス鎖RNAの末端に（UTPの代わりに）UMPがあることを示す観察へのリンクを提供し（42）、これは、コロナウイルスのマイナス鎖RNAが、核酸 Dicer は、未知のウリジン特異的エンドヌクレアーゼによってリン酸化された末端を切断します。もし確認されれば、この核酸加水分解活性は、発生期のマイナス鎖の 5 2 末端から nsp9 のオリゴマー UMP 化形態を放出するのに役立つ可能性があります。タンパク質プライミングにおけるnsp9の役割の可能性は、nsp9（およびnsp8）がコロナウイルスゲノムの3末端近くにある保存されたシス作用性RNAエレメントと決定的かつ特異的に相互作用することを示した以前の逆遺伝学研究とも一致している。45）。この報告書によると、これらの以前の観察は今後さらなる研究を通じて再検討され、拡張される可能性があります。
要約すると、我々のデータは、N 末端で RdRp に結合した独自のネステッド ウイルス酵素タグの比活性を決定しました。コロナウイルスでは、この新たに発見された NiRAN 媒介 UMPylator/NMPylator 活性は、Mn2+ および隣接する Asn 残基に依存し、N 末端第一級アミンとの (低エネルギー) ホスホルアミデート結合の形成を引き起こすために使用されます。nsp8|9 切断部位での Mpro 媒介切断を通じて、nsp9 標的を NMP 化に使用できます。これは、プロテアーゼと RdRp に及ぶ NiRAN ドメイン間の機能的結合を示しています。nsp12 NiRAN 活性部位と nsp9 標的における重要な残基の保存は、SARS-CoV-2 を含む 2 つのコロナウイルスから得られたデータと組み合わせると、nsp9 の NMP 化がコロナウイルスであるという強力な証拠を提供します。 保存された特徴もウイルス複製における重要なステップです。入手可能なデータから、タンパク質誘導性 RNA 合成における nsp9 の NMP 化型の特定の役割は、コロナウイルスやその他の入れ子型ウイルスにとって合理的なシナリオであり、NiRAN は他の未確認タンパク質も標的とする可能性があるとの結論に至りました。ウイルスを規制してください。ホストの対話。これが確認されれば、ウイルスRNA合成におけるタンパク質プライマーの関与により、以前に検出されたコロナウイルスとピコルナウイルス様スーパーグループ間のMpro/3CLproおよびRdRpドメインの配列親和性が増加することになる(9)。これらは最近確立されたピソニウイルス類で統一されている( 46) カテゴリにあります。
私たちのデータは、この研究で特定された基本的、選択的、保存的酵素活性が抗ウイルス薬の標的として使用できることも示しています。NiRAN の活性部位にある保存された nsp9 N 末端の結合（およびその後の修飾）を妨げる化合物は、異なる（亜）属の感染症による動物およびヒトのコロナウイルスの治療に適した、効果的で汎用性の高い抗ウイルス薬として開発できる可能性があります。 、SARS-CoV-2および中東呼吸器症候群コロナウイルスを含む。
この研究で生成されたコロナウイルスタンパク質のコード配列は、HCoV-229Eに感染したHuh-7またはSARS-CoV-2に感染したVero E6から単離されたRNAを使用してRT-PCRによって増幅され、標準的なクローニング手順を使用して挿入されました。pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) または pASK3-Ub-CHis6 (47) 発現ベクター (SI 付録、表 S1 および S2)。単一コドン置換は、PCR ベースの部位特異的突然変異誘発によって導入されました (48)。MBP 融合タンパク質を生成するために、大腸菌 TB1 細胞を適切な pMAL-c2 プラスミド構築物で形質転換しました (SI 付録、表 S1)。融合タンパク質をアミロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、第Xa因子で切断した。続いて、以前に記載されているように、C 末端 His6 タグ付きタンパク質を Ni 固定化金属アフィニティークロマトグラフィー (Ni-IMAC) によって精製しました (49)。ユビキチン融合タンパク質を産生するために、大腸菌 TB1 細胞は、適切な pASK3-Ub-CHis6 プラスミド構築物 (SI 付録、表 S1 および表 S2) およびユビキチン特異的 C 末端加水分解酵素 1 (Ubp1) をコードする pCGI プラスミド DNA を使用しました。変身（47）。C 末端 His6 タグ付きコロナウイルスタンパク質は、以前に記載されているように精製されました (50)。
HCoV-229E nsp12-His6 の自己 NMP 化テストは、EAV nsp9 (16) に記載されているように実行されました。つまり、nsp12-His6 (0.5 μM) には、50 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)-KOH、pH 8.0、5 mM ジチオスレイトール (DTT)、6 mM MnCl2、25 μM バッファーが含まれており、インキュベートします。指定された NTP と 0.17 μM の一致する [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) を 30 °C で 30 分間処理しました。nsp12 媒介 nsp9 NMP 化の他のすべての (標準) NMP 化アッセイでは、反応条件は次のように調整されます: 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) の存在下での nsp12-His6 (0.05 μM) および nsp9-His6 (4 μM) )、5 mM DTT、1 mM MnCl2、25 μM の示された NTP、および 0.17 μM の一致する [α32-P]NTP。30℃で10分間インキュベートした後、反応サンプルをSDS-PAGEサンプルバッファー：62.5mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンHCl(pH6.8)、100mM DTT、2.5%SDS、10%グリセロールおよび0.005%ブロモフェノールと混合した。青。タンパク質を90℃で5分間加熱することにより変性させ、12% SDS-PAGEにより分離した。ゲルを固定し、クーマシー ブリリアント ブルー溶液 (40% メタノール、10% 酢酸、0.05% クーマシー ブリリアント ブルー R-250) で染色し、脱色し、リン光イメージング スクリーンに 20 時間曝露します (NMP 化から nsp12 を検出するため)。または (最長) 2 時間 (nsp9 NMP 化を評価するため)。タイフーン 9200 イメージャー (GE Healthcare) を使用して画面をスキャンし、ImageJ を使用して信号強度を分析しました。
MS 分析では、1 μM nsp12-His6 および 10 μM nsp9 (ヘキサヒスチジンタグなし) を NMP 化分析 (SI 付録、表 S1) に使用し、500 μM の UTP および GTP の増加した濃度を使用しました。濃度と予想されるタンパク質の品質に応じて、MassPrep カラム (Waters) を備えた Waters ACQUITY H-Class HPLC システムを使用して、1 ～ 10 µL の緩衝タンパク質溶液をオンラインで脱塩しました。脱塩されたタンパク質は、バッファー A (水/0.05% ギ酸) とバッファー B (アセトニトリル/0.045% ギ酸) の次の勾配によって Synapt G2Si 質量分析計 (Waters) のエレクトロスプレー イオン源に溶出されます。カラム温度は60℃および流速0.1mL/分:5%Aで2分間均一濃度で溶出し、その後8分以内に95%Bまでの直線勾配で溶出し、さらに4分間95%Bを維持する。
500 ～ 5000 m/z の質量範囲の正イオンが検出されます。グルフィブリノペプチド B は、自動質量ドリフト補正のために 45 秒ごとに測定されます。MaxEnt1 拡張機能を備えた MassLynx 計測器ソフトウェアを使用して、ベースラインを差し引いて平滑化した後、平均スペクトルをデコンボリューションします。
UMP化HCoV-229E nsp9を、シーケンシンググレードの修飾トリプシン(Serva)を添加することによって消化し、37℃で一晩インキュベートした。Chromabond C18WP スピンカラム (部品番号 730522; Macherey-Nagel) を使用してペプチドを脱塩および濃縮しました。最後に、ペプチドを 5% アセトニトリルと 0.1% ギ酸を含む 25 μL の水に溶解しました。
サンプルは、Orbitrap Velos Pro 質量分析計 (Thermo Scientific) を使用して MS によって分析されました。カスタムエンドマウント 50 cm?? を装備した究極の nanoâ HPLC システム (Dionex)2.4 μm 磁気ビーズが充填された 75 μm C18 RP カラム (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Proxeon ナノスプレー ソースを介してオンラインで質量分析計に接続します。トリプシン消化溶液 6 µL を内径 300 µm ×?? に注入します。1 cm C18 PepMap 前濃縮カラム (Thermo Scientific)。溶媒として水/0.05% ギ酸を使用し、サンプルは自動的にトラップされ、流速 6 µL/min で脱塩されました。
水/0.05% ギ酸 (溶媒 A) および 80% アセトニトリル/0.045% ギ酸 (溶媒 B) の次の勾配を使用して、流速 300 nL/min でトリプシンペプチドの分離を達成しました。 ５分間、その後数分以内に４５％Ｂまで３０Åの直線勾配を加え、５分以内に９５％溶媒Ｂまで直線的に増加させる。クロマトグラフィー カラムをステンレス鋼ナノエミッター (Proxeon) に接続し、2,300 V の電位を使用して質量分析計の加熱されたキャピラリーに溶離液を直接スプレーします。Orbitrap 質量分析計の分解能 60,000 のサーベイ スキャンが関連付けられています。線形イオントラップ衝突誘起解離またはオービトラップ検出と組み合わせた高エネルギー衝突解離を使用して、少なくとも 3 つのデータ MS/MS スキャンを 30 秒間動的に除外し、分解能は 7,500 です。
投稿時間: 2021 年 8 月 3 日